Fragmentacija DNA z metodo TUNEL in transmembranski mitohondrijski potencial merjen z DiOC6(3)

Opis preiskave

TUNEL tehnika je najbolj specifična metoda za določevanje apoptotičnih celic. V pozni fazi apoptoze pride do fragmentacije jedrne DNK. V programu apoptoze se aktivirajo endonukleaze, ki razrežejo DNK na kratke fragmente, ki so dolgi 50-300 baznih parov in imajo izpostavljene 3'-OH proste konce. V TUNEL reakciji se fluorescenčno označeni nukleotidi vežejo na 3'-OH proste konce DNA ob pomoči encima terminalne deoksinukleotidil transferaze. Na ta način je omogočena detekcija fragmentirane DNK s pretočnim citometrom. Rezultate podajamo kot delež celic, ki imajo fragmentirano DNK. DiOC6(3) je karbocianatno barvilo, ki se uporablja za zaznavanje membranskega potenciala. To kationsko barvilo se nakopiči na hiperpolarizirani strani membrane in se potem vsidra v membrano. Količina barvila, ki se veže v membrano pa je odvisna od mitohondrijskega potenciala.